Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
- в случае проведения соответствующего испытания, количество погибших животных в 4 группах по 5 морских свинок, которым был введен раствор провокационного токсина и его разведения, указывает на то, что провокационная доза приблизительно соответствует 100 LD50,
- границы доверительного интервала определения (Р = 0,95) составляют от 50 до 200% от оцененного значения активности,
- при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности.
Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех достоверных экспериментов.
2.7.7. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАКЦИНЫ КОКЛЮША
Активность вакцины коклюша определяют путем сравнения дозы вакцины, необходимой для защиты мышей от эффектов летальной дозы Bordetella pertussis, вводимой интрацеребрально, с количеством препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, требующимся для получения такой же защиты.
За Международную Единицу принимают активность в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенной вакцины коклюша. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.
Выбор и распределение испытуемых животных. В испытании используют здоровых мышей подходящей линии из одной партии, возрастом менее 5 недель. Разница в массе между самым тяжелым и самым легким животным не должна превышать 5 г. Мышей делят на шесть групп не менее чем по 16 особей и 4 группы по 10 особей. Используют мышей одного пола; в иных случаях самцы и самки должны быть равномерно распределены по группам.
Выбор провокационного штамма и приготовление суспензии для провокации. Выбирают подходящий штамм B. pertussis, способный привести к гибели мышей в течение 14 дней после интрацеребральной инъекции. Если в течение 48 часов после инъекции погибает более 20% мышей, штамм является неподходящим. Выполняют один пересев штамма и суспендируют собранные B. pertussis в растворе, содержащем 10 г/л гидролизата казеина R и 6 г/л натрия хлорида R, и имеющем показатель рН от 7,0 до 7,2, либо в другом подходящем растворе. Определяют степень мутности суспензии. Готовят ряд разведений с использованием того же раствора и назначают их по одному каждой из групп по десять мышей. Каждой мыши вводят интрацеребрально дозу (0,02 или 0,03 мл) разведения, назначенного группе, к которой она принадлежит. Через 14 дней подсчитывают в каждой группе количество выживших мышей. Из этих результатов вычисляют ожидаемую степень мутности суспензии, содержащей 100 LD5o в каждой провокационной дозе. Для оценки активности испытуемой вакцины производят
свежий пересев того же штамма B. pertussis и готовят из собранных организмов суспензию со степенью мутности, соответствующей приблизительно 100 LD50 в каждой провокационной дозе. Готовят 3 разведения провокационной суспензии.
Определение активности. Готовят 3 серийных разведения испытуемой вакцины и 3 аналогичных разведения препарата сравнения так, чтобы для каждого из промежуточных разведений ожидаемая степень защиты мышей от летальных эффектов провокационной дозы B. pertussis составляла 50%. Предлагаемые дозы составляют 1/8, 1/40 и 1/200 доли человеческой дозы испытуемой вакцины и 0,5 МЕ, 0,1 МЕ и 0,02 МЕ препарата сравнения. Каждая из доз содержится в объеме, не превышающем 0,5 мл. 6 разведений назначают по одному каждой из групп, состоящих не менее, чем из 16 мышей, и вводят каждой из мышей внутрибрюшинно одну дозу разведения, назначенного группе, к которой относится данное животное. Через 14-17 дней каждому животному из этих групп вводят интрацеребрально одну дозу суспензии для провокации. Суспензию для провокации и три ее разведения назначают по одному каждой из групп по 10 мышей и вводят каждой из мышей интрацеребрально одну дозу каждой суспензии, назначенной группе, к которой относится данное животное. Мышей, погибших в течение 48 часов после провокации, не учитывают при оценке результатов. В каждой из групп подсчитывают количество мышей, выживающих после 14 дней. Активность испытуемой вакцины вычисляют относительно активности препарата сравнения на основе количества животных, выживших в каждой из групп из не менее 16 особей.
Результаты испытания являются достоверными, если:
- как для испытуемой вакцины, так и для препарата сравнения, 50% защитная доза заключена в интервале между наибольшей и наименьшей дозами препарата, введенными морским свинкам,
- количество погибших животных в 4 группах по 10 мышей, которым была введена провокационная суспензия и ее разведения, указывает на то, что провокационная доза приблизительно соответствует 100 LD50,
- при статистическом анализе не выявляется отклонений от линейности и параллельности.
Испытание может быть выполнено повторно, но если было проведено более одного определения, то при оценке активности должны учитываться результаты всех достоверных экспериментов.
